免疫组化技术步骤（免疫组化步骤）

免疫组化技术步骤?一.固定、脱水、包埋，下面我们就来聊聊关于免疫组化技术步骤?接下来我们就一起去了解一下吧!

免疫组化技术步骤

一.固定、脱水、包埋

取组织放入4%多聚甲醛里面固定3-4小时时间根据标本大小适当调整。取适当大小组织放入包埋盒中进行脱水。每个染缸液体体积约200ml每次脱水可以装20个包埋盒。依次进入:75%酒精1.5小时、95%酒精1.5小时、95%酒精1小时、无水乙醇1.5小时、无水乙醇1小时、二甲苯一号0.5小时、二甲苯二号0.5小时。打开包埋机分别开启冷台冷点石蜡槽组织槽进行工作。然后用铁饭盒承装石蜡块并放入包埋机组织槽中加热溶解。将脱水后的组织连同包埋盒依次放入机器组织槽中然后再放入石蜡饭盒一号进行第二遍浸蜡然后石蜡饭盒二号进行三次浸蜡。选大小符合的模具先调整机器滴蜡的速度不宜过快防止有气泡。然后在模具中滴入液体石蜡然后从饭盒二号中拿出浸后的包埋盒打开用镊子取出组织放入模具中。然后用包埋盒的另一半盖住模具再滴入少许石蜡后放到冷台上冷却。按上述步骤继续包埋下一个蜡块。

二.切片、制片

打开切片机固定蜡块(可提前4度冰箱预冷一下)调整刀片和蜡块的距离。然后调整切片厚度先粗切看到完整的蜡片并且有组织后切换厚度调整到自己想要切的厚度。用力均匀右手摇动切片左手用毛笔接片。如片子打卷可以用毛笔按着蜡片的边缘再缓慢切这样可以得到相对平整的片子。用毛笔和镊子将片子或者带状片子托起放入水槽中展片水温在40度左右。然后用防脱片载玻片轻轻捞起载玻片的边缘尽量不要触碰水槽底部防止底部气泡上浮残留在片子上。然后标注切片编号放到烤片机上烤片30分钟。

三.组织化学染色

室温脱蜡、水化:二甲苯一号10分钟、二甲苯二号8分钟、二甲苯三号8分钟、无水乙醇5分钟、90%乙醇3分钟、80%乙醇3分钟、70%乙醇3分钟。蒸馏水3分钟*3次PBS3分钟*3次。热抗原修复换新的切片架放入水化后的切片。配置抗原修复液(一包柠檬酸钠粉末配置2升PBS溶液)用铁饭盒或者锅加热煮沸。温度控制在96-98度。然后将切片放入热锅中15分钟最后自然冷却室温。PBS五分钟*2次蒸馏水3分钟*2次。免疫组化笔画圈:取出组织甩干水分可用吸水纸吸干水珠。用组化笔画圈围住组织圆圈完整。灭活内源酶活性:将切片放入湿盒中盒中加入少量蒸馏水滴加3%过氧化氢(二抗试剂盒中A一滴或者50微升剂量详见二抗说明书)室温孵育10分钟。PBS三分钟*3次蒸馏水水洗三分钟。封闭非特异性位点:甩干水分吸干水珠加山羊血清封闭液(二抗试剂盒B一滴或者50微升)放入湿盒内室温10分钟。甩掉封闭液滴加一抗盖住组织然后放入湿盒内4摄氏度过夜。(一抗浓度见抗体说明书提前稀释后分装并在负二十度冰箱保存。每张片子一抗剂量不定看组织面积大小xxxxx癌组织一张20微升左右。第二天4度冰箱取出湿盒室温复温30分钟PBS三分钟*三次蒸馏水洗涤三分钟。甩干水分吸干水珠滴加二抗(二抗试剂盒C)一滴或者50微升室温孵育10分钟。PBS三分钟*三次蒸馏水水洗三分钟。每张片子滴加一滴或者50微升链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(二抗试剂盒D)室温孵育10分钟PBS三分钟*三次蒸馏水水洗三分钟。每张片子滴加两滴或者100微升DAB溶液显微镜下观察3-10分钟。染色合适即可终止染色自来水冲洗。苏木素复染1-2分钟细胞核变蓝色即可终止自来水或者PBS冲洗反蓝(可用0.5%氨水反蓝)。1%盐酸酒精分化3秒自来水冲洗三分钟。脱水:70%酒精1分钟、80%酒精1分钟、95%酒精2分钟、无水乙醇4分钟、二甲苯一号3分钟、二甲苯二号3分钟。凉干片子后滴加适量中性树胶封片盖上盖玻片小心气泡。晾干半天即可。显微镜下拍照。

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