无缝克隆（同源重组）技术以简单、快速、高效等特点深受小伙伴们的喜欢！但也有部分小伙伴在进行长片段连接的时候遇到了涂板不长克隆的情况，或者连接没有问题但是同源臂两端出现位点突变等奇怪现象。聚合美帮你一一排除这些雷，你会发现搞定长片段克隆并不难！
多片段无缝克隆连接原理示意图
一 如何提高长片段的连接效率？
短片段无缝克隆实验很容易就成功，而长片段无缝克隆比较麻烦。
长片段的扩增比较难，需要用扩增能力强的超保真酶来做，我们推荐聚合美的“长又亮”Neo超保真酶（货号MF947），它特有的PCR Buffer，让聚合美特制的延伸增强剂和抗GC抑制剂能够得到充分的溶解，使其功能最大化，对长片段有非常好的扩增能力。
其次，扩增得到片段后，一定要做胶回收（推荐MF029），跑电泳确定条带的浓度，而不仅仅是靠OD值。最后，算好片段和载体的摩尔比，找到最恰当的使用浓度和体积。
比较长片段与短片段、单片段与多片段克隆，同样的操作，同样的试剂，唯一不同的就是体系内目的片段和载体的数量，也就是摩尔数。为了提高连接效率，我们必须提高目的片段和载体的密度，使得载体和目的片段在反应体系内“邂逅”并“相爱”的机会更多，连接效率就更高！使用这种方法高难度的长片段拼接也变得轻而易举！
赛事回顾
据此原理，聚合美专门为长片段和高难度片段连接设计了5x高浓度mix（货号：MF018-plus），是您解决长片段连接的终极神器。一经推出就得到了市场的强烈反响。
MF018-plus比其他品牌对比图（感谢NIBS客户提供）
2xSM为T品牌2x无缝克隆mix
CK（诺）为国产V品牌5x无缝克隆mix
5xSM为聚合美5x无缝克隆mix
二 如何避免无缝克隆连接成功却引入同源臂附近突变？
无缝克隆mix市面上很多，但做得精效率高的却不多。最大的原因是该mix组分多，稍微质控不慎就会影响效率；其次，mix最核心组分是超保真酶，某些品牌虽然能生产无缝克隆mix，但是其超保真酶技术并不过关，导致出现克隆连接成功，但测序后发现同源臂附近偶尔有突变，影响后续表达或者其他操作。
聚合美超保真酶技术经过多年的打磨升级，已经完全能胜任无缝克隆需求，升级款MF018-plus里头就配备了聚合美最具特色的“长又亮”Neo超保真酶，确保连接成功的同时不引入新的突变，让您实验顺心放心！
三 限时秒杀，长片段无缝克隆实验做起来！
神器在手，克隆我有！5x高浓缩 mix 限时秒杀价249元/10T那些半路折戟的长片段连接赶紧做起来!
聚合美无缝克隆系列产品六折优惠(即日起至：2021年11月30日)。欢迎大家咨询订购，申请试用装，欢迎小伙伴们添加聚合美官方微信，为您解决实验中碰到的各种问题。
温馨提示：（注意以下细节，克隆少走弯路）
请仔细阅读产品说明书，严格按照说明书操作。
制备载体及目的片段时，一定要纯化后通过DNA电泳对比条带亮度进行定量，仅靠OD值是不够的（因为某些时候OD值可能虚高）。载体和模板浓度过小时(<20ng/μl)，建议多做几管，合并在同一管回收，提高浓度。浓度过高时，建议稀释，以确保加入体积>1ul。
体系混匀后37℃反应15-30分钟即可，如果同源臂GC含量高，可以提高到50-55 ℃。建议在PCR仪器上进行，水浴锅等常规仪器对温度控制不精确（尤其37℃），影响重组效率。
进行阳性对照反应，排除其他实验材料及操作因素的影响。
重组产物加入的量不要超过感受态体积的1/10，如果转化子较少，可以将所有的产物转化并将所有的转化液涂板。涂板时建议将菌液离心富集，保留100μl重悬、涂板。
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