引物二聚体(引物探针问题)

实时定量PCR分析的部分实施需要被优化以确保所有反应参数被准确地设置，从而获得准确的结果。荧光定量PCR中常见的困难包括引物、探针、反应抑制和软件分析等。今天 *** 姐分享一下她在引物和探针方面的经验。

实时定量PCR (qPCR)几乎是现代分子生物学中最重要和应用最广泛的核酸定量检测技术。一个成功的定量PCR实验离不开准确的实验设计和操作过程。

引物二聚体

引物二聚体的形成是最常见的问题之一。当引物对之间的一些序列具有同源性时，可以形成引物二聚体。如果引物在PCR反应过程中退火形成二聚体，Taq DNA聚合酶可以延伸二聚体以形成比原始引物更长的产物，这可以导致循环中的退火错误。

问:引物二聚化会导致什么问题？

引物二聚体对反应的影响很大程度上取决于反应中使用的化学物质。基于荧光探针的反应受引物二聚体的影响不大，这是因为引物二聚体区域很少出现探针退火断裂的现象。这时候引物的竞争是要考虑的主要问题。基于双链DNA的染料结合反应受引物二聚体的影响很大。因为染料的结合模式是非特异性的，所以在反应过程中监控的荧光信号可以被增强。这会相应地改变Ct值，并使结果出现偏差。

问:如何确定引物二聚体是否存在？

凝胶电泳是一种显示引物二聚体的极好方法。引物二聚体在凝胶底部形成扩散带，通常低于100 bp。单独凝胶电泳分析的缺点是灵敏度只能达到纳克级，所以可能得不到结果。

解链曲线也是显示引物二聚体的一种方法。如果扩增具有优异的特异性，则在实时荧光定量PCR板上的每个反应孔的解离曲线中会出现窄的单峰。引物二聚体的荧光强度很低，显示出宽的“波形”,表明它在大约70℃时熔化(见图1。).

问:如何设计和优化实验以避免引物二聚体？

更好在引物设计阶段就采取简单的预防措施，从一开始就避免二聚体的形成。如果出现引物二聚体，有很多方法可以减少或消除反应中的引物二聚体。

1.之一步是优化热循环条件，主要是提高退火温度。在大多数情况下，两步循环(从95℃变性步骤到60℃退火和延伸步骤)有利于强扩增，因此引物设计中设定的成功退火温度为60℃。

2.可以降低引物浓度，甚至不同比例的正向引物和反向引物都有帮助。大多数情况下，每种引物的理想终浓度为200~600 nM，但必要时可降至60 nM。

3.镁的更佳浓度一般为3 mM左右，高于此浓度，容易形成引物二聚体。

4.如果引物形成二聚体的倾向没有被评估，它应该被补充和重新设计(如果必要的话)。通常，更好使用热启动DNA聚合酶，并在冰上反应。

5.理论上，对于相同的目标，应该同时检测多个引物组。这实际上可以节省很多时间，因为如果这些引物中的一个可以立即起作用，那么在优化过程中花费的时间就可以减少。

以及引物和探针的储存。

引物和探针保存不当会导致降解和丧失特异性，从而影响反应效率。影响引物和探针稳定性的主要因素有保存温度、保存时间、是否长时间暴露、保存的引物和探针的浓度以及保存液的成分。

问:如何长期保持引物和探针的稳定性？

保持引物和探针的稳定性有四个关键点。冻干引物在储存时间和温度方面具有更好的灵活性。底漆一旦复溶，应在-20℃保存，超过一年的应监测其功能是否下降。对于已标记的引物和探针，应采取措施避免暴露标记物(如使用不透明试管，避光保存)，以延长其使用寿命。

引物的浓度也会影响其稳定性。建议底漆储存浓度不低于10 μm；实际上，在大多数情况下，100微米的底漆浓度更容易操作。引物和探针也应分开存放，以减少冷冻和解冻时间，尤其是标记的引物和探针。最后，TE缓冲液可以形成比水更稳定的环境。另外，含0.1 mM EDTA的TE缓冲液(标准TE含1 mM EDTA)是理想的溶液，因为有些PCR反应可能对EDTA有一定的残留敏感性。

NTC放大

当形成引物二聚体时，如果使用与DNA双链结合的染料，在NTC反应中也可以观察到荧光信号。还有一种情况。在污染物存在的情况下，无论是基于探针还是双链DNA结合染料的反应，在NTC孔中都会观察到引物二聚体的扩增。这可能是一个随机事件。并非所有NTC都会被放大，这通常是由不常见的采样误差引起的。如果扩增发生在每个NTC反应中，很可能有一种或两种试剂被污染。

问:如何防止或消除污染？

1.使用干净的工作台，用含有核酸降解试剂的溶液擦拭工作台。

2.含有dUTP和UDG的预混合溶液用于降解来自前序列PCR反应的产物，以防止前序列PCR反应的污染。

3.尝试用新的反应管替换不同来源的试剂，并找出有问题的试剂。

4.在条件允许的情况下，在不同的实验位点建立反应，尤其是以质粒为对照时(质粒容易扩散，不易清除)。

实时定量PCR分析的优化过程确实需要时间，但是花的时间是值得的。该分析结果不仅灵敏度更高、动态范围更大，而且准确度高、效率高、重复性好，为实验提供了可靠的数据。

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