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动物培养(细胞培养步骤)

动物细胞培养（细胞培养的步骤）

动物细胞培养是从动物体内取出相关组织，分散成单个细胞(使用胰蛋白酶或胶原酶)，然后放入合适的培养基中，让这些细胞生长增殖。

种族发生

1907年，哈里森以淋巴液为培养基，在无菌条件下培养蛙胚胎神经组织数周，观察神经细胞突起的生长过程，从而创造了用盖片覆盖凹坑的玻璃滴培养法，为动物组织体外培养奠定了基础。后来有人将悬滴培养法改进为双盖培养，提高了传代效率，减少了污染。1923年，卡雷尔设计了卡尔烧瓶培养法，扩大了组织存活空室。1951年，厄尔发明了一种体外培养动物细胞的合成培养基。1951年，Pomerat设计了一种灌注室，使细胞生活在不断更新的培养基中，便于显微照相和细胞代谢研究。1957年，Graff利用灌注技术进一步提高了细胞悬浮培养的效率。1957年，Dulbecco等人利用胰蛋白酶消化和液体培养基获得单层细胞培养物。单层培养的出现极大地促进了组织培养的发展。此后，单层培养成为组织培养中广泛使用的技术。20世纪60年代以后，大规模动物细胞培养技术开始起步并逐步发展。20世纪80年代以后，随着基因工程和其他细胞工程技术的发展，细胞培养技术已经成为转基因技术、生物制药等许多技术的基础，在现代生物技术中占有重要地位。

培养基成分

细胞体外培养所需的营养物质与体内基本相同，如糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等。细胞所需的上述物质严格按照其种类和所需量配制的培养基称为合成培养基。由于动物细胞内部环境中仍有一些成分尚未研究清楚，因此需要添加动物血清，以提供与生物体内相似的环境。所以在使用合成培养基时，通常需要添加一些血清、血浆等天然成分。

培养基的特性

液体培养基，通常含有动物血清。

文化条件

无菌无毒环境:对培养液及所有培养器皿进行消毒，通常在培养液中加入一定量的抗生素，防止污染。此外，还应定期更换培养基，以消除代谢产物，防止细胞代谢产物的积累对细胞本身造成伤害。

营养素:无机物(无机盐、微量元素等。)、有机物(糖、氨基酸、促生长因子等。)

血清和血浆(提供细胞生长所需的营养物质)

以及温度和pH值(36.5±0.5 ℃℃, 7.2 ~ 7.4)

气体环境(95% 空气体+5% CO的混合气体)

5%的CO气体用于保持培养溶液的pH值稳定。

基本过程

取动物胚胎或幼小动物器官和组织。将材料切成碎片，用胰蛋白酶(或胶原酶)处理(消化)，形成分散的单细胞。将处理后的细胞转移到培养基中，制成一定浓度的细胞悬液。分散在悬浮液中的细胞迅速附着在瓶壁上，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到相互接触时，细胞将停止分裂增殖，出现接触抑制。这时就需要再次用胰蛋白酶处理细胞。然后配制成一定浓度的细胞悬液。此外，原代培养是从体内取出后立即进行的细胞和组织培养。当细胞从动物和植物中生长迁移，形成生长晕并不断增加时，科学家再进行传代培养，即将原代培养的细胞分成几份，接种到几份培养基中，使其继续生长增殖。通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞系。培养50代以上时，大部分细胞已经老化死亡，但仍有部分细胞具有无限传代的特性，即癌变。此时的细胞称为细胞系。

在培养基中加入胰岛素可以促进细胞对葡萄糖的摄取。

分类

1根据细胞类型:原代细胞培养，传代细胞培养

原代细胞:从体内取出动物的各种组织，用各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，在合适的培养基中培养，使细胞能够存活、生长和繁殖。这个过程叫做原代培养。培养的细胞是正常的动物细胞，一般培养10代就不增殖死亡。

细胞的传代:传代培养是细胞培养的常规种子保存方法之一，是所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中充满后，需要稀释并接种到多个瓶中，这样细胞才能继续生长。这个过程叫做通过。通过传代培养可以获得大量实验所需的细胞。细胞传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要细致的无菌操作。培养的细胞是癌性的或人工癌性的，理论上它们可以无限增殖。癌症的途径有很多:癌基因突变、病毒感染、与癌症供体隔离、物理或化学方法(如紫外线和化学试剂)等。

2.根据培养方法:贴壁细胞培养、半悬浮细胞培养和悬浮细胞培养。

区分

不同的培养基:植物细胞(固体培养基)，动物细胞(液体培养基)。

培养基成分不同:动物细胞培养必须用动物血清，植物组织培养不需要，需要添加植物生长素。

不同的产品:植物组织培养通常会产生新的植物个体，而动物细胞培养会产生只含有同种细胞的细胞系(或细胞群)，因为动物体细胞一般不能表达其全能性。

原理不同:植物组织培养的原理是植物细胞的全能性，而动物细胞培养的原理是细胞的增殖和分化。

过程不同:植物组织培养的过程是脱分化和再分化，动物细胞培养的过程是原代培养和继代培养。

技术应用

生物制品的生产(如单克隆抗体的制备)

转基因动物的培育

检测有毒物质，判断其强度。

医学研究(生理学、病理学和药理学)